Introducción
El uso de modelos de correlación in vitro-in vivo (IVIVC) es parte integral de los procesos de investigación y desarrollo de fármacos. Estos modelos pueden predecir con exactitud el comportamiento in vivo de los medicamentos a partir de observaciones in vitro, y sus aplicaciones son útiles en áreas que incluyen: la valoración de las propiedades farmacocinéticas, el aseguramiento de la calidad en programas de farmacovigilancia y el control de calidad durante el desarrollo industrial de una formulación. La correlación se define, según la Agencia de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU (FDA), como el modelo matemático que describe la dependencia entre el comportamiento in vitro de una propiedad o cualidad y la medida de la intensidad de una respuesta in vivo, tal que ésta sea relevante para el fármaco en estudio. La propiedad de los medicamentos sólidos, comúnmente aplicada in vitro en investigación y desarrollo y pruebas de calidad, es la tasa de disolución o de liberación del fármaco de la forma farmacéutica; mientras que la respuesta in vivo a correlacionar es la concentración o cantidad absorbida que llega al plasma en la unidad de tiempo 1. De esta manera, con una IVIVC con base en pruebas de disolución, es posible predecir el comportamiento in vivo de algunos fármacos.
Si bien se reconoce que existen correlaciones entre la disolución in vitro y la absorción in vivo, se ha avanzado poco en el desarrollo de modelos integrales que comprendan la valoración de propiedades complementarias, de tal forma que mejoren la capacidad predictiva de los métodos in vitro. Lo anterior es necesario si se tienen en cuenta los factores físicos, químicos y biológicos que contribuyen tanto al proceso de disolución como al de absorción. Entre los factores se señalan las propiedades fisicoquímicas del fármaco, las propiedades biofarmacéuticas del medicamento y las características fisiológicas de las vías de absorción en el paciente.
La solubilidad a su vez, está determinada por factores como el estado de ionización del fármaco, que cualifica diferentes propiedades de los compuestos, según las diferentes condiciones de pH en el sitio de disolución. Esto es altamente relevante porque el cuerpo humano contiene gradientes de pH, especialmente en el tracto gastrointestinal (GI), que dan lugar a diferentes perfiles de absorción dependientes del pH in vivo 2 .
El objetivo de este trabajo fue desarrollar un modelo integral para predecir el comportamiento farmacocinético in vivo en la fase de absorción de fármacos antirretrovirales, con base en mediciones de permeabilidad y solubilidad in vitro. Lo anterior se enmarca en los avances de las ciencias farmacéuticas, la industria y la regulación sanitaria, que han consolidado la valoración de la calidad de los medicamentos por medio de ensayos de Biodisponibilidad in vivo en sujetos humanos. Sin embargo, los análisis de racionalidad en costos económicos y éticos, que obligan al desarrollo de alternativas sustitutas a la inclusión de humanos, entre ellas las que tienen en cuenta propiedades fisicoquímicas y de permeabilidad de las moléculas, de acuerdo con la clasificación Biofarmacéutica (BCS) 3.
Materiales y Métodos
Reactivos
Los estándares y los productos de Estavudina (d4T), Lamivudina (3TC) y Zidovudina (AZT) fueron proporcionados por Humax Pharmaceutical (Medellin, Colombia). Dulbecco's modified Eagle's médium (DMEM) con L-Glutamina, aminoacidos no esenciales (NEA 100X), solución de Hanks (HBSS), Ácido N-(2-Hidroxietil)-piperazina-N'-(2-etanosulfónico), sal de sodio (HEPES), Bicarbonato de Sodio y Penicilina/Estreptomicina 100X fueron compradas a Sigma-Aldrich y el Suero Fetal Bovino a Gibco. Los reactivos se prepararon según las indicaciones del fabricante.
Disolución
Las cinéticas de disolución in vitro fueron realizadas siguiendo los lineamientos de la Farmacopea de los Estados Unidos en el dislolutor Pharma Aliance Group, Modelo TDT- 08L, con el metodo de paletas, a una rotación de 50 rpm, en 900 mL agua desgasificada, a una temperatura de 37° C ± 0.5, durante 10, 20, 30, 45 y 60 min.
Cultivo de células Caco-2
Las células Caco-2 (HTB-37) fueron obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC). Se usaron células entre los pases 30 y 50 en medio DMEM con alto contenido de glucosa (4.5 g/L) y suplementado con L-Glutamina, 10% de suero fetal bovino, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de penicilina/estreptomicina. Para los ensayos de permeabilidad se sembraron a una densidad de 6x104 células/cm2 en insertos transwell con membrana de policarbonato (0.4 µm, 1.12 cm2; Corning Costar). La integridad de las monocapas se evaluó mediante la medición de la Resistencia Eléctrica Transepitelial (TEER), al comienzo y al final de cada ensayo. Solo monocapas con valores de TEER mayores a 200 Ω/cm2 fueron usadas.
El coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) fue determinado de la cantidad de fármaco transportado por unidad de tiempo y fue calculado mediante la siguiente ecuación:
Papp=(∆Q/∆t)/(AxCo)
Donde (ΔQ/Δt) es la concentración acumulada en el compartimento receptor (µmol/seg) versus el delta de tiempo, A: es la superficie del inserto (cm2) y C0: es la concentración inicial en el compartimento donador (µM). La integridad del sistema fue evaluado por el coeficiente de permeabilidad (P). El coeficiente de Permeabilidad aparente (Papp) está asociado al valor del Coeficiente de permeabilidad.
P= (∆Q/∆t) x (Concentración del compartimiento receptor/Area de inserto )
La determinación de integralidad se concluye cuando se comparan los valores promedios obtenidos experimentalmente con estándares definidos para la molécula en estudio. El flujo inicial del fármaco (J) se determinó de la pendiente de la regresión lineal de la cantidad de fármaco transportado versus el tiempo y la concentración inicial en el compartimento donador.
Farmacocinética en animales
Todos los protocolos y procedimientos fueron revisados y aprovados por el Comité de Etica para Investigación en Animales de CIDEIM, en ellos se constataron los compromisos y lineamientos internacionales sobre tener el mayor respeto y cuidado, el reconocimiento de su valor intrínseco como especie viva, así como la profunda reflexión sobre las posibilidades de remplazo, la reducción y el refinamiento de las técnicas y procedimientos. Se siguieron todos los lineamientos de las leyes de Colombia en el uso de animales de laboratorio 4-6. En cada estudio farmacocinético se incluyeron diez conejos New Zeland por grupo, con pesos entre 2.5-3.2 kg. Los conejos fueron mantenidos en el bioterio bajo todas los cuidados y condiciones estándares para el manejo de animales (20-25º C; 30-70% humedad relativa, ciclo natural de Luz/Oscuridad), con acceso a agua y comida ad libitum hasta 2 h antes del estudio y después de una hora de administrar el medicamento por vía oral en una suspensión acuosa. Cada grupo recibió una sola dosis de Estavudina 8.9 mg/kg, Lamivudina 20.8 mg/kg o Zidovudina 41.7 mg/kg. Se tomaron muestras de 2 mL de sangre de la vena marginal de la oreja, antes de la administración del medicamento y durante 6 h después para Lamivudina y Zidovudina, en los intervalos: 0.0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, y 6.0 h. Para Estavudina se colectaron muestras durante 3 h después de la administración, en los intervalos: 0.0, 0.08, 0.17, 0.25, 0.33, 0.50, 0.75, 1.0, 2.0 y 3.0 h. Las muestras se centrifugaron a 1,500 rpm durante 20 min y el plasma se analizó por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) para la cuantificación de cada principio activo (PA).
Farmacocinetica en humanos
El estudio y los protocolos fueron aprobados por el Comité de Etica Institucional del Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Médicas (CIDEIM), de acuerdo con la Declaración de Helsinki (Octubre 2008), los lineamientos éticos internacionales para investigación en sujetos humanos del Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS) y el Ministerio de Protección Social Colombiano Resolución 2378 de 2008. EL diseño del estudio fue abierto, aleatorizado, de una sola vía, un solo periodo y una sola dosis. Se seleccionaron participantes de sexo masculino, con edad entre 18-35 años, dentro de ±15% de su peso corporal ideal, normales al examen físico y con exámenes de laboratorio clínico dentro de los rangos establecidos (bioquímicos, hematológicos, función hepática, función renal, función tiroidea y uroanálisis). A cada participante se le explico los riesgos del estudio y cada uno proporcionó de manera voluntaria el consentimiento informado escrito. Diez voluntarios recibieron una sola capsula de Estavudina 40 mg (Humax Pharmaceutical) y el segundo grupo de 9 voluntarios recibieron una sola tableta combinada de Lamivudina 150 mg/Zidovudina 300 mg (Humax Pharmaceutical) con 240 mL de agua. Se colectaron muestras de sangre (8 mL) antes de la administración del medicamento y durante 12 h después de su administración, a partir de un catéter mantenido con solución salina. Los intervalos de muestreo correspondieron: 0.0, 0.17, 0.33, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 6.0, 9.0 y 12 h.
Análisis de las muestras
Las muestras de plasma humano y de conejo fueron analizadas en un UPLC equipado con detector UV con arreglo de diodos (LaChrome Ultra, Hitachi). Se usó una columna Chromolith(r) Performance RP-18 column (100x4.6 mm, Merck), una fase móvil de buffer Acetato de Amonio 10 mM y acetonitrilo (96:4, v/v, pH 6.0) a una temperatura de 35° C y un flujo de 1.2 mL/min. Las proteínas plasmáticas fueron precipitadas con metanol y cada procedimiento aplicado fue validado de acuerdo a los lineamientos de la FDA 7.
Análisis estadístico
Los parámetros farmacocinéticos fueron calculados usando métodos no compartimentales, con transformación logarítmica de los datos de concentración. La vida media de eliminación (t1/2) fue estimada de la regresión lineal de la curva de concentración (log) versus tiempo. El área bajo la curva (ABC) de concentración plasmática en el tiempo se determinó por el metodo trapezoidal con el software "PKSolutions Pharmacokinetics Noncompartimental Data Analysis(r)" (Summit Research Services, Windows 2.0.6 Excel 2002 Edition(r)). Para la validación de los métodos bioanalíticos y los cálculos de linealidad se utilizó el software "Statgraphics(r) Plus 4.1. Professional Version" (Statistical Graphics Corp).
Resultados
Desarrollo y validación de métodos bioanalíticos
Los métodos para la determinación y cuantificación de Estavudina, Lamivudina y Zidovudina fueron desarrollados en plasma para los estudios farmacocineticos y en HBSS para los ensayos de permeabilidad. Para la validación se realizaron curvas de calibración en cada una de las matrices, donde se prepararon diez estandares de diferente concentración (cinco réplicas por cada concentración), diluyendo una solución stock en HBSS o plasma libre de fármacos. La linealidad fue evaluada en el rango de 0.25 a 6.0 µg/mL para d4T y 3TC, y 0.25 a 8.0 µg/mL para AZT. Los estándares preparados en HBSS y en plasma fueron estables por más de 90 días a -75 +/- 5° C. Todos los métodos cumplieron con los criterios de: linealidad (r² ≥0.8), precisión (CV <15%), exactitud (CV <15%), recuperación (>80%), límite inferior de detección y cuantificación (Tabla 1).
| Parametro | Solución salina de Hanks | Plasma humano | ||||
| Stavudine | Lamivudine | Zidovudine | Stavudine | Lamivudine | Zidovudine | |
| Linealidad | y= 1.061x+0.019 | y= 0.971x-0.025 | y= 0.814x+0.085 | y= 1.055x-0.022 | y= 0.942x-0.055 | y= 0.567x-0.016 |
| R²= 0.9990 | R²= 0.999 | R²= 0.9901 | R²= 0.9958 | R²= 0.995 | R²= 0.9993 | |
| Precisión (Coeficiente de variación %) | 2.07 | 1.92 | 2.36 | 2.76 | 3.48 | 1.45 |
| Exactitud (error relativo %) | 0.32 | 0.14 | 1.25 | 4.48 | 0.23 | 0.15 |
| Limite inferior de detección (µg/mL) | 0.010 | 0.005 | 0.023 | 0.048 | 0.025 | 0.003 |
| Limite inferior de cuantificación (µg/mL) | 0.026 | 0.014 | 0.075 | 0.111 | 0.078 | 0.005 |
| Recuperación (%) | 99.05 | 99.87 | 97.12 | 95.61 | 99.21 | 99.65 |
Perfil de disolución
Las cineticas de disolución se realizaron según parámetros farmacopeicos a los 10, 15, 20, 30, 45, 60 min en 12 ensayos independientes. El valor promedio fue usado para calcular la regresión lineal logaritmica y el modelo matematicos de los perfiles de disolución, donde y es el porcentaje de farmaco disuelto y x es el tiempo:
Estavudina: y = 0.0097ln(x) + 3.6246
Lamivudina: y = 0.0345ln(x) + 5.0272
Zidovudina: y = 0.0975ln(x) + 5.6808
Interpolación de periodos similares de acumulación en monocapas de células Caco-2 y de área bajo la curva acumulada (ABC) de la farmacocinética en humanos y conejos fue realizado (Tabla 2).
| Droga | Tiempo (h) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.17 | 0.25 | 0.33 | 0.50 | 0.75 | 1.00 | ||
| Zidovudine | Disolución | 83.60 | 86.90 | 89.40 | 93.00 | 96.80 | 99.50 |
| Accumulación Caco-2 | 0.95 | 2.10 | 3.63 | 7.73 | 16.39 | 27.89 | |
| ABC acumulada conejo | 2.37 | 5.04 | 8.22 | 15.24 | 26.07 | 36.19 | |
| ABC acumulada humano | 2.70 | 5.80 | 9.55 | 18.07 | 31.48 | 44.02 | |
| Lamivudine | Disolución | 94.80 | 96.20 | 97.10 | 98.50 | 99.90 | 100.90 |
| Accumulación Caco-2 | 0.74 | 1.67 | 2.94 | 6.54 | 14.53 | 25.60 | |
| ABC acumulada conejo | 0.75 | 1.64 | 2.82 | 5.86 | 11.64 | 18.33 | |
| ABC acumulada humano | 0.17 | 0.38 | 0.67 | 1.46 | 3.12 | 5.27 | |
| Stavudine | Disolución | 92.40 | 92.70 | 93.00 | 93.40 | 93.70 | 94.0 |
| Accumulación Caco-2 | 0.76 | 1.70 | 3.00 | 6.64 | 14.68 | 25.78 | |
| ABC acumulada conejo | 3.64 | 7.57 | 11.89 | 20.66 | 32.87 | 43.40 | |
| ABC acumulada humano | 2.23 | 4.72 | 7.63 | 13.94 | 23.53 | 32.48 | |
Ensayos de permeabilidad en Caco-2
Se estandarizaron los parámetros para los ensayos de permeabilidad en monocapas celulares. Adicional a la TEER para evaluar la integridad de las monocapas, se utilizó dos marcadores de permeabilidad, Metoprolol (alta) y Manitol (baja), para transporte transcelular y paracelular respectivamente. La Papp de metoprolol fue de 47.2x10-6 cm/seg (SD ± 5.5x10-6, n= 5) y para manitol no fue posible determinar su Papp porque las concentraciones en el compartimento receptor no fueron detectables.
La determinación de los cambios de concentración en el compartimento receptor a 15, 30, 45, 60, 90 and 120 minutos en 10 ensayos independientes nos permitió evaluar los indicadores de difusión (Tabla 3). Los datos obtenidos de las cinéticas de orden 1 fueron ajustados por el modelo matemático de mínimos cuadrados, con coeficientes de correlación >0.99, donde y es la concentración (µg/mL) y x es el tiempo (h):
Estavudina: y = 0.9548Ln(x) + 2.1457
Lamivudina: y = 0.9655Ln(x) - 0.0574
Zidovudina: y = 0.8391Ln(x) + 1.6946
Estas ecuaciones fueron aplicadas a la correlación de los datos con respecto a la disolución en una hora y a la farmacocinética en humanos y en conejos.
| Parametro* | Unidades | Stavudine | Lamivudine | Zidovudine |
|---|---|---|---|---|
|
|
cm/s | 6.4 ± 1.8 | 7.0 ± 2.0 | 20.3 ± 4.7 |
| Flujo ( |
µg/cm2/min | 0.081 ± 0.003 | 0.041 ± 0.005 | 0.063 ± 0.004 |
| *Media ± DS (n= 10) Papp= Coeficiente de Permeabilidad Aparente | ||||
Ensayos farmacocinéticos en conejos
Las dosis administradas a los animales (d4T 0.60 mg/Kg, 3TC 2.13 mg/Kg y AZT 4.14 mg/Kg) fueron normalizadas con respecto a las dosis de los voluntarios, para la proporcionalidad entre ellos (Conejo/Humano). Estos factores fueron: d4T 14, 3TC 9.78 y AZT 10.06. Los resultados de concentración fueron usados para evaluar la fase de absorción y de eliminación en la curva del logaritmo de concentración versus el tiempo, donde y es la concentración del analito en el plasma y x es el periodo de muestreo, en la fase de eliminación (R² >0.97), entonces:
Estavudina: y = -0.6906x + 1.3588
Zidovudina: y = -0.6206x + 2.9383
Lamivudina: y = -0.7271x + 4.2558
Los datos simulados obtenidos con estas ecuaciones, ajustados por el factor de dosis en humanos, fueron usados en los análisis farmacocinéticos no compartimentales para evaluar las áreas bajo las curvas parciales y acumuladas (ABC0-t, ABCAcum) de acuerdo con el método residual de Wagner-Nelson (Fig. 1), calculada por:
Cp= (F * Dosis * Ka / Vd * Ka - Ke )(e-ke*t - e -Ka ke*t)
Expresada como:
Cp = I (e-ke*t - e -Ka*t)
Los principales parámetros farmacocinéticos se describen en la Tabla 4. La concentración plasmática de los tres antirretrovirales alcanzó su valor máximo rápidamente y después disminuyó para alcanzar los niveles basales a las 6 h post-administración. Estos resultados demuestran la rápida absorción de los tres productos y la alta permeabilidad de los tres principios activos. AZT alcanzó la mayor biodisponibilidad de los tres antirretrovirales.
| Producto | Farmacocinética conejo | Farmacocinética humano | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Zidovudine | Lamivudine | Stavudine | Zidovudine | Lamivudine | Stavudine | ||
| Cmax | µg/mL | 12.17 | 3.31 | 3.15 | 2.12 | 0.94 | 0.73 |
| Tmax | h | 0.75 | 1.00 | 0.33 | 0.33 | 1.00 | 0.50 |
| T1/2 | h | 1.12 | 0.95 | 1.00 | 0.72 | 2.68 | 1.37 |
| ABC (0-t) | h*µg/mL | 25.17 | 6.87 | 4.38 | 2.16 | 3.51 | 1.67 |
| ABC(0-∞) | h*µg/mL | 26.00 | 6.99 | 4.90 | 2.16 | 3.51 | 1.67 |
| ABPM (0-t) | µg-h*h/mL | 41.34 | 11.62 | 4.97 | 3.02 | 10.41 | 3.02 |
| ABPM(0-∞) | µg-h*h/mL | 47.71 | 12.53 | 7.10 | 3.02 | 10.41 | 3.02 |
| Cmax= maxima concentración Tmax= tiempo requerido para llegar a la máxima concentración ABC= area bajo la curva en el tiempo ABPM= Area bajo el primer momento de la curva | |||||||
Farmacocinética en humanos
Los perfiles farmacocinéticos fueron el principal parámetro derivado como referencia para las correlaciones in vitro-in vivo (Tabla 4). El perfil plasmático de concentración versus tiempo después de la administración de una dosis oral de Estavudina (40 mg) o Lamivudina (150 mg)/ Zidovudina (300 mg) se muestra en la Figura 2.
La regresión lineal del logaritmo de la concentración plasmática en el tiempo, proporcionó el modelo matemático para la fase de eliminación (R² >0.97).
Estavudina: y = -0.5046x + 0.0649
Zidovudina: y = -0.9678x + 0.9018
Lamivudina: y = -0.2595x + 2.4725
Los tres antirretrovirales evaluados fueron rápidamente absorbidos después de la administración oral (Tabla 4).
Correlaciones in vitro-in vivo
Disolución versus Permeabilidad. Se compararon los porcentajes de cambios en concentración entre cero y una hora (tiempo máximo de disolución) y los cambios de concentración en el compartimento receptor de las monocapas celulares de los ensayos de permeabilidad (Tabla 2). Los modelos matemáticos de regresión lineal calculados mostraron que los datos de disolución son idóneos para predecir la permeabilidad por difusión (R² >0.80).
Estavudina: y = 14.581x - 1,350, R²= 0.8368
Lamivudina: y = 3.8844x - 371.6, R²= 0.8401
Zidovudina: y = 1.6163x - 138.14, R²= 0.8655
Donde y son los porcentajes de ABC acumulados en Caco-2 y x es el porcentaje de disolución. Estas funciones pueden ser implementadas para predecir la calidad de los medicamentos en terminos de la permeabilidad de las materias primas de diferentes origenes durante el proceso de manufactura.
Correlaciones in vivo-in vivo
Conejo versus Humanos. Se correlacionaron las areas bajo la curva acumuladas y se aplicó un análisis de regresión estadística de minimos cuadrados (Fig. 3). Se observó una alta correlación entre el perfil farmacocinético en humanos y el modelo animal (Estavudina R2= 0.987, Lamivudina R2= 0.885 y Zidovudina R2= 0.989). La ABC0-t para Zidovudina en ambas especies mantuvo la proporcionalidad con respecto a la dosis. Sin embargo, para Lamivudina aunque la razón de dosis Conejo/Humano fue de diez veces, la ABC0-t solo excedió dos veces el valor en humanos. Para Estavudina, la razón de la dosis fue 15 veces mayor en conejos con respecto al humano, pero solo excedió dos veces y media la ABC0-t en humanos.
Los valores de Cmax expresaron las mayores diferencias interespecie con relación a la fracción absorbida, por lo cual no se recomienda el uso de este parámetro para predecir el comportamiento de los fármacos. El tiempo para alcanzar la máxima concentración (Tmax) de Zidovudina fue dos veces más lento en humanos que en conejos (0.75 h and 0.33 h, respectivamente), mientras que para Lamivudina y Estavudina los valores fueron similares (Tabla 4). Por lo anterior, para estos dos fármacos el Tmáx en el modelo conejo estuvo relacionado directamente con el resultado esperado en humano. La comparación de los resultados in vivo, en conejo y humano con base en ABC0-t, se basó en los perfiles plasmáticos y los modelos de eliminación en la curva del logaritmo de concentración versus tiempo para los cambios simulados en los mismos períodos (Método Wagner-Nelson).
Correlación de porcentajes acumulados de ABC en humanos versus conejos
Los modelos matemáticos de la correlación lineal y los factores correspondientes (R2) a la recta de regresión por mínimos cuadrados fueron:
Zidovudina: y = 0.9838x - 3.4354, R² = 0.988
Lamivudina: y = 0.8562x - 9.3888, R² = 0.885
Estavudina: y = 0.9709x + 7.6027, R² = 0.987
Los valores de x representan el ABC acumulada en conejos interpolados para y/o ABC acumulado en humanos en el mismo periodo para dosis equivalentes. Los factores de correlación demostraron la capacidad de la especie conejo para predecir la Biodisponibilidad en humanos, por la cantidad de fármaco absorbido y acumulado en el tiempo, con una probabilidad cercana o mayor al 90%. Estos modelos matemáticos superan los análisis de variabilidad biológica y diferencias inter-especies, porque cada sujeto respondió de manera integral conjugando las propiedades fisiológicas del animal y del sujeto humano bajo las condiciones del ensayo.
Correlaciones in vitro-in vivo
Disolución versus ABC0-t Humanos. Se compararon los perfiles de disolución y la farmacocinética en animales y humanos (Tabla 2). Se encontró una correlación directa y exponencial entre el porcentaje del fármaco disuelto in vitro y la ABC acumulada in vivo en el humano (R2 >0.99).
Estavudina: y = 1.4842e0.5376x
Lamivudina: y = 0.0902e0.6906x
Zidovudina: y = 1.7444e0.5619x
En estas ecuaciones x representa los valores de porcentaje de disolución y el ABC in vivo proyectada para el mismo periodo de tiempo. Los datos farmacocinéticos en el modelo animal mostraron resultados igualmente satisfactorios con modelos exponenciales y factores de correlación mayores a 0.98. La relación exponencial directa entre el porcentaje de disolución y la cantidad de fármaco disponible en el plasma sanguíneo (R² >0.98), fue útil para prever la eficacia de los procesos de absorción a partir de los datos del porcentaje de disolución in vitro.
Correlación in vitro-in vivo
Permeabilidad versus ABC en Humanos. Los valores de ABC acumulados en el sistema Caco-2 fueron correlacionados con los valores de ABC in vivo en las dos primeras horas, tiempo durante el cual se realizaron los ensayos de permeabilidad. Se encontró una relación directamente proporcional para Lamivudina, mientras que para Estavudina y Zidovudina fue logaritmica (Fig. 4). Las siguientes funciones expresan la relación directa entre el porcentaje de transferencia en Caco-2 y el Porcentaje de ABC Acumulada post-administración.
Estavudina: y = 11.820ln(x) - 2.3697 R²= 0.9305
Zidovudina: y = 16.488ln(x) - 7.2008 R²= 0.9332
Lamivudina: y = 0.172(x) + 0.3678 R²= 0.9961
Los resultados de las comparaciones en el modelo animal fueron igualmente satisfactorios con funciones exponenciales y factores de correlación mayores a 0.90.
Regresión linear múltiple
Farmacocinética en humanos vs % disolución y permeabilidad en Caco-2. La interpretación final de las relaciones de los resultados in vitro (% de disolución y la cantidad difundida a través de monocapas Caco-2), con respecto a la cantidad de fármaco acumulado en el tiempo in vivo en humanos, fue realizada por regresión lineal múltiple en el intervalo de confianza de 95% (p <0.05), para las siguientes funciones:
Variables Independientes: % Disolución y ABC Acumulada en Caco-2.
Variable dependiente: ABC Acumulada en humanos en la primera hora post-absorción.
Zidovudina: R2= 0.991
ABCAcuHum=2.681+(0.0149*% de Disolución)+(1.170*ABCAcuCaco-2)
Lamivudina: R2= 0.999
ABCAcuHum=-1.713+(0.0185*% Disolución)+(0.202*ABCAcuCaco-2)
Estavudina: R2= 0.986
ABCAcuHum = 2.255+(0.0232*% Disolución)+(1.488*ABCAcuCaco-2)
Resultados similares con correlaciones superiores a 0.97 se obtuvieron de la regresión múltiple para las mismas variables en modelo animal.
Discusión
Las normas de regulación sanitaria exigen el aseguramiento de la calidad de los medicamentos en ensayos de biodisponibilidad y bioequivalencia in vivo en sujetos humanos adultos sanos. Este estudio demuestra la validez de aplicar pruebas sustitutas in vitro, para disminuir los costos y los riesgos éticos por incluir humanos en investigación, teniendo en cuenta bases científicas razonables. Las pruebas se apoyan en las propiedades de disolución y permeabilidad de los principios activos, según la Clasificación Biofarmacéutica (BCS) 3. Zidovudina, Lamivudina y Estavudina son sustancias Tipo I, altamente solubles en agua y altamente permeables en las pruebas de absorción 8. Los fármacos Tipo I en productos orales de liberación inmediata, pueden ser exencionados de los estudios en sujetos humanos, sin embargo actualmente la garantía de calidad está dada al demostrar biodisponibilidad y/o Bioequivalencia en ensayos in vivo
Valoración fisicoquímica y ensayo de disolución
Los productos analizados cumplieron las especificaciones de calidad para la valoración de contenido, la uniformidad de dosis y los perfiles de disolución, de acuerdo con la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP34, NF29, 2011) y documentos afines 9-13. En menos de 20 min fue disuelto el 99.0 % de Lamivudina, el 91.2% de Zidovudina y el 93.5% de Estavudina. La solubilidad ratificó la recomendación de exención de estudios de bioequivalencia in vivo para productos de liberación inmediata como Lamivudina, Zidovudina y/o Estavudina 14,15. El perfil de disolución confirmó que el 81.8% de la Zidovudina fue liberada de las tabletas en los primeros 10 min y el 93.4% de la Lamivudina. Las cápsulas de Estavudina liberaron más del 90.0% del principio activo en los primeros 15 min.
Ensayos de permeabilidad en Caco-2
Los resultados de alta y baja permeabilidad fueron referidos a los estándares de Metoprolol y Manitol respectivamente, que estuvieron en concordancia con otros estudios y con los lineamientos de la FDA 16,17, lo cual confirma la idoneidad de nuestro sistema in vitro para discriminar entre compuestos de alta y baja permeabilidad. Los resultados obtenidos para Estavudina y Lamivudina fueron muy similares y encajan bajo la categoría de alta permeabilidad. La permeabilidad de Zidovudina fue tres veces mayor que Estavudina y Lamivudina, lo cual está relacionado con sus propiedades fisicoquímicas de lipofilicidad. Esta metodología cumple con los requisitos de las guias de ensayos in vitro para la evaluación de las propiedades de solubilidad y permeabilidad contempladas en el Sistema de Clasificación Biofarmaceútica (BCS) y otras publicaciones en la materia 18-21. La funcionalidad del sistema Caco-2 se comprobó por el coeficiente de permeabilidad aparente (Papp), coeficiente de Permeabilidad (P) y coeficiente de Flujo (J).
Estudios farmacocinéticos
El modelo animal conejo demostró ser eficiente para valorar procesos de absorción de acuerdo con las propiedades biológicas y bioquímicas similares a los humanos, y justifica su uso en la investigación pre-clínica 22,23. Se siguieron las guías sobre buenas prácticas de laboratorio y todas las relacionadas con el uso de animales en estudios de Biodisponibilidad y Bioequivalencia 24-29. Los tres fármacos lograron la concentración máxima en plasma en una hora o menos, siendo cerca de 20 min para Estavudina. El tiempo de vida media en conejos para Lamivudina fue 0.95 h, inferior a la experimental en humanos (2.68 h), un poco mayor para Zidovudina 1.12 h (0.72 h) e inferior para Estavudina de 1.0 h (1.37 h).
Los estudios en humanos fueron los referentes de calidad de los medicamentos para medidas de concentración y ABC en 12 h continuas 30-33. Los parámetros evaluados fueron: concentración máxima del principio activo en plasma (Cmáx), Área Bajo la curva de Concentración en el tiempo (ABC0-t) y tiempo para concentración máxima (Tmáx).
Este estudio demostró la biodisponibilidad in vivo de los productos Zidovudina 300 mg/Lamivudina 150 mg tabletas y Estavudina 40 mg cápsulas de Humax Pharmaceutical S.A, y el cumplimiento de los estándares de calidad de acuerdo a las propiedades de disolución, contenido y demás atributos fisicoquímicos prescritos para estas formas farmacéuticas. Se comprobó la capacidad de difusión y permeabilidad de los principios activos a través de las monocapas celulares, en proporción directa con la farmacocinética de absorción in vivo en el modelo animal y en voluntarios adultos sanos. Los métodos analíticos y procedimientos validados aplicados en ensayos in vitro demostraron las correspondencias directas entre los resultados obtenidos y los estudios farmacocinéticos in vivo, con coeficientes de correlación mayores de 0.85.
Conclusión
En este estudio se logró el propósito de implementar metodologías analíticas, que habitualmente se aplican en la investigación y desarrollo de nuevos fármacos, para medir propiedades físicas y biológicas, con resultados coherentes con los obtenidos en los estudios de Biodisponibilidad en sujetos humanos, acordes con los principios de una IVIVC. En todas las comparaciones se demostraron valores de regresión lineal por mínimos cuadrados con factores de correlación cercanos o superiores 0.90, en la combinación de comparaciones como:
in vitro-in vitro: Permeabilidad - Disolución
in vitro-in vivo: Disolución - Farmacocinética
in vitro-in vivo: Permeabilidad - Farmacocinética
in vivo-in vivo: Relación Farmacocinética modelo Animal - Humano
Los resultados de este estudio sustentan la propuesta de revisar los requerimientos regulatorios vigentes en Colombia, relacionados con los estudios in vivo como pruebas de bioequivalencia para productos de liberación inmediata con principios activos clasificados como BCS-I, específicamente antiretrovirales nucleosídicos inhibidores de Transcriptasa Reversa.
Se propone, fomentar la capacidad de la industria farmacéutica para estandarizar métodos in vitro e in vivo en conejos como modelo animal, complementarios a las pruebas de disolución, con el fin de validar los resultados entre éstas y para dar la robustez y potencia, indispensable a la garantía de calidad para el comportamiento in vivo.