La leptospirosis es una enfermedad zoonótica, que afecta principalmente a personas de bajos ingresos. La infección es causada por la espiroqueta Leptospira interrogans que comprende más de 200 variantes serológicas en 23 grupos. Su incidencia está asociada con factores sociales, ocupacionales y climáticos con una distribución y preocupación mundial debido a que puede causar la muerte en humanos. Las presentaciones clínicas no específicas de la enfermedad y la dificultad para su diagnóstico por laboratorio causan una subestimación del número de casos y su incidencia. En humanos, la tasa de incidencia en algunas regiones puede ser tan alta como 975 casos por cada 100,000 habitantes1.
El aborto espontáneo es una de las complicaciones más comunes que ocurren durante el primer trimestre del embarazo, y 1 de 4 mujeres experimentan un aborto durante su etapa reproductiva2. La pérdida temprana del embarazo está definida como el final del embarazo antes de las 20 semanas de gestación o pérdida de peso fetal por debajo de los 500g. Las principales causas del aborto son genéticas, inmunológicas, anormalidades anatómicas, defectos hematológicos o endócrinos así como factores ambientales como infecciones causadas por diversos patógenos3. La infección por leptospirosis aguda durante el embarazo ha sido asociada con aborto espontáneo y muerte fetal durante el primer trimestre y el aborto puede ocurrir como consecuencia de una falla sistémica4-6. Sin embargo, todavía no se sabe si el aborto y la muerte fetal ocurren como un efecto directo o indirecto de la infección.
La leptospirosis en México fue reportada por primera vez en el estado de Yucatán en 19207, y desde entonces, diferentes estudios en humanos y animales reservorios confirman su condición endémica en Yucatán donde se ha reportado un 14.2% de prevalencia8-9. Sin embargo, la presencia de L. interrogans en mujeres con aborto espontáneo no se ha demostrado. La detección de leptospirosis en mujeres embarazadas y fetos, podría ayudar al diagnóstico diferencial de aborto, y generar información acerca de la prevención de la enfermedad.
El objetivo de este estudio fue estimar la frecuencia de infección por Leptospira interrogans en mujeres con aborto espontáneo en dos hospitales del estado de Yucatán, México.
Se realizó un estudio transversal en mujeres con aborto espontáneo, el cual se llevó a cabo en el Hospital Comunitario de la ciudad de Ticul (enero-junio 2008) y el Hospital Materno Infantil en la ciudad de Mérida, Yucatán (febrero-junio 2009), ambos localizados en el estado de Yucatán, México. El protocolo fue aprobado para su realización por parte del comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Yucatán.
Las muestras de sueros fueron obtenidas de un estudio previo en toxoplasmosis realizado en un hospital con una alta frecuencia de abortos (120 mujeres de 7 millones en 600 embarazos en el 2007) reportados10. Solo 81 muestras de 100 mujeres con aborto espontáneo examinadas de junio a mayo de 2009 fueron incluidas en el estudio. Cuarenta y cinco muestras (suero y tejido placentario) correspondieron al Hospital Comunitario de Ticul y 36 muestras pertenecientes al Hospital Materno Infantil de Mérida. Los sueros fueron almacenados en un congelador a -70°C en el Laboratorio de Enfermedades Infecciosas y Parasitarias de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Yucatán. En adición, 40 muestras de placenta embebidos en parafina procedentes de ambos hospitales fueron analizados.
La prueba de referencia para Leptospirosis, microaglutinación (MAT), fue utilizada para estimar la frecuencia de infección y serovar infectante. MAT fue realizada de acuerdo al procedimiento de WHO11 y Haake et al 12. Doce serovares prevalentes en Yucatán fueron utilizados como antígenos en MAT. Estos fueron Pomona, Canicola, Hardjo, Tarassovi, Panama, Icterohamorrhagiae, Grippotyphosa, Pyrogenes, Bratislava, Borincana, Cynopteri y Autumnalis8,9. La microaglutinación fue observada en microscopio Leica DM1000 con un condensador de campo oscuro. Un título ≥100 fue utilizado como punto de corte para determinar la positividad. Todos los títulos por arriba de este valor fueron considerados como evidencia de exposición. Cuando se observó reacción cruzada en una muestra, el serovar con el título más alto fue considerado como el infectante.
Este ensayo se utilizó para detectar infección reciente por L. interrogans. Una placa de poliestireno fondo plano (F8 Maxisorp Nunc-INMUNO MODULE), fue preparada absorbiendo un pool de 12 serovares de L. interrogans sonicados (10mg/ml diluido en solución buffer de carbonato pH 9.6). Una solución de BSA al 2% fue utilizada como agente bloqueador así como una solución PBS-Tween 20 como solución de lavado. El anticuerpo secundario fue un conjugado anti IgM humana (µ-cadena) unido con la enzima peroxidasa (SIGMA), y OPD fue utilizado como revelador. 2.5 M H2SO4 se utilizó para detener la reacción. La DO se midió en un lector de microplacas Benchmark plus (Bio-Rad, Hercules CA) a 490nm. El punto de corte utilizado fue el promedio de las muestras negativas más dos desviaciones estándar.
El ADN se extrajo de tejidos embebidos en parafina de placenta. Corte de 10 µm fueron colocados en un tubo de 1.5 mL a los cuales se les adicionó 500 µl de xileno y se procedió a incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente para remover la parafina. Al término, el xileno fue enjuagado con etanol al 100% y al 75% respectivamente durante 30 minutos cada uno. Posteriormente, el tejido fue lavado con PBS. Para remover el PBS, se agregaron 200 µL de buffer de lisis (20 mg/mL de proteinasa K, 10 µL de Tris-HCl solución 1M, 2 µl de EDTA 0.5 M, 100 µL de SDS al 10% y 838 mL agua destilada grado molecular) al tubo de 1.5 mL que contiene cada muestra de tejido y se incubó a 52°C toda la noche. Después de la incubación, el tubo fue centrifugado a 12,000 g por 10 min para remover residuos. El sobrenadante obtenido. El sobrenadante obtenido fue transferido a un tubo de 1.5 mL y se procedió a realizar la extracción de ADN por el método convencional de fenol-cloroformo. El ADN obtenido se resuspendió en 50 µL de agua destilada.
Para detectar L. interrogans, una PCR semi anidada amplificando un fragmento de adaptado del procedimiento realizado por Murgia et al13. En este estudio, se utilizaron los oligonucleótidos iniciadores: Lepat 1, 5'-GAG TCT GGG ATA ACT TT-3'; Lepat 2, 5'-AGA AAT TTG TGC TAA TAC CGA ATG T-3' y L4, 5'-GAT TTT TCG GGT AAA GAT-3'. La mezcla de PCR se preparó de acuerdo a las instrucciones de la DNA polimerasa seleccionada (HotMasterMix, Eppendorf, Hamburgo Alemania) utilizando 100 ng/µL de ADN y 0.5 mM de cada oligonucleótido. Las condiciones de amplificación fueron. Las condiciones de amplificación consistieron en: 1 ciclo inicial a 94ºC x 5 min, 40 ciclos de 94ºC x 1 min, 47º x 1.5 min, 72º x 2 min; 1 ciclo de 72ºC x 7 min y enfriado a 4ºC hasta detener el protocolo. Los productos obtenidos en este procedimiento fueron observados, posterior a una electroforesis en gel de agarosa, en un fotodocumentador de luz ultravioleta (Bio-Rad, Hercules CA).
Se utilizó el control interno de ADN beta-actina para detectar si las muestras de ADN analizadas no se encontraban degradadas, para esto se amplificó un fragmento de 290 bp del exón III del gen beta-actina. Los oligonucleótidos iniciadores fueron: Primer 1: 5' ACC CAC ACTGTG CCC ATC TA3' y Primer 2: 5' CGG AAC CGC TCATTG CC 3'. La preparación de la mezcla de PCR fue la misma utilizada para el protocolo de detección de Leptospira interrogans utilizando 60°C como temperatura de alineamiento.
El rango de edad de las mujeres con aborto espontáneo fue de 14 a 42 años con una media y desviación estándar de 24.7±7.6 años. Las frecuencias de mujer por edad, paridad y edad al momento del aborto se presentan en la Tabla 1. La mayoría de las mujeres abortaron a las 5-13 semanas de gestación.
| Factor | Frecuencia | % |
|---|---|---|
| Edad (años) | ||
| 14-19 | 22 | 27.2 |
| 20-34 | 50 | 61.7 |
| ≥35 | 9 | 11.1 |
| Paridad | ||
| Primigestantes | 40 | 49.3 |
| Multigestantes | 40 | 49.3 |
| Edad al abortar (semanas) | ||
| ≤4 | 8 | 9.9 |
| 5-8 | 27 | 33.4 |
| 9-13 | 30 | 37.0 |
| 14-17 | 9 | 11.0 |
| 18-20 | 5 | 6.2 |
La frecuencia global de infección por L. interrogans en las 81 mujeres con aborto, utilizando la técnica de MAT, fue de 13.6%. Diez (12.3%) de las mujeres infectadad fueron procedentes del Hospital Comunitario de Ticul (n=45) y una (1.3%) en el Hospital Materno Infantil de Mérida (n=36). No se identificó co-infección con toxoplasmosis en la muestras positivas a L. interrogans.
Cinco de 12 serovares evaluados fueron encontrados incluyendo Hardjo, Gryppotyphosa, Borincana, Bratislava y Cynopteri. Los serovares con alto número de casos positivos y altos títulos fueron Hardjo y Grypptyphosa con títulos 1:400(Tabla 2).
| Serogrupo | Serovar | Serogrupo | Titulo anticuerpos | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Positivos | % | 1:100 | 1:200 | 1:400 | ||
|
|
|
5 | 45.5 | 2 | 2 | 1 |
|
|
|
2 | 18.2 | 1 | 1 | |
|
|
|
2 | 18.2 | 2 | ||
|
|
|
1 | 9.1 | 1 | ||
|
|
|
1 | 9.1 | 1 | ||
| Porcentaje | 63.6 | 18.2 | 18.2 | |||
Ninguna de las 45 muestras de placenta evaluadas por PCR utilizando los oligonucleótidos Lepat1 y Lepat2 fueron positivos en las muestras del Hospital Comunitario de Ticul. Para evaluar si el extracto de ADN de las muestras se encontraba en buen estado, las muestras fueron re-analizadas por PCR mediante oligonucleótidos universales que amplifican un fragmento de 290 pares de bases del exón III del gen beta-actina. Primer 1: 5' ACC CAC ACTGTG CCC ATC TA3' y Primer 2: 5' CGG AAC CGC TCATTG CC 3'. La preparación de la mezcla de PCR fue la misma utilizada para el protocolo de detección de Leptospira interrogans utilizando 60°C como temperatura de alineamiento.
De las 81 mujeres con aborto, el grupo de mujeres de 20 a 34 años fue el más frecuente probablemente porque es la edad más común para embarazarse en Yucatán (Tabla 1).
La mayoría de los abortos ocurrieron en la primera etapa de embarazo (antes de las 12 semanas de embarazo), un valor similar a lo reportado en la guía para el diagnóstico y tratamiento de aborto espontáneo por la Secretaría de Salud de México 14 y Chile 15.
La positividad a MAT en mujeres con aborto espontáneo obtuvo un porcentaje similar (13.6%) a los valores encontrados en poblaciones abiertas mixtas (14.1, 14.0, 14.2) por Vado et al. 8, también en Yucatán. El serovar más frecuente encontrado en el estudio, fue Hardjo (asociado a ganado vacuno), seguido de Gryppotyphosa (asociado con animales silvestres y cerdos), los cuales han sido reportada su presencia en humanos y animales domésticos de Yucatán en estudios previos 8,9. En Australia, Faine y Adler 4 reportó un caso mortal de infección intrauterina por Leptospira hardjo, identificada en placenta y tejido fetal de 30 semanas. En nuestro estudio, dos mujeres fueron positivas a ELISA IgM y MAT, una reaccionando al serovar Hardjo y otra el serovar Gryppotyphosa, en ambos casos con títulos de anticuerpos de 1:400 que sugieren que estas dos mujeres cursaban una infección reciente o aguda por Leptospira. Sin embargo, debido a que no se encontraron leptospiras en tejido placentario, no se puede asociar directamente con la principal causa de aborto. La WHO 11 reportó que la leptospirosis durante el embarazo puede llevar al aborto, muerte fetal o leptospirosis congénita, dependiendo del período de embarazo, pero solo unos pocos casos han sido reportados.
Una alta frecuencia de casos positivos de leptospirosis se encontraron en el Hospital Comunitario de Ticul comparado con el Hospital Materno Infantil localizado en un área urbana. Estos resultados concuerdan con los reportados por otros autores 8,16, quienes observaron que las áreas rurales son un alto riesgo de adquirir leptospirosis. Estos probablemente este asociado a una alta prevalencia de leptospirosis en animales (vacas, cerdos y perros) y el contacto de la gente con ellos, en el sur de Yucatán, donde el Hospital Comunitario de Ticul está localizado. Sin embargo, no se obtuvo información del paciente acerca de una exposición directa con animales. Gainder et al. 17, reportaron un caso de leptospirosis en una mujer nulípara de 20 años de edad (26 semanas de embarazo) altamente expuesta a animales de granja y ratas, como Dadhwal et al. 18, reportaron un caso de leptospirosis en una mujer de 36 semanas de embarazo. Baytur et al. 19, por otra parte, reportaron un caso en una nulípara de 26 semana de embarazo expuesta a ovejas.
La espiroqueta Leptospira interrogans es de cuidado para las mujeres embarazadas como se evidencia en este estudio en el cual, dos mujeres presentaron anticuerpos contra L. interrogans en las pruebas de MAT y ELISA IgM. Diferencias entre las regiones fueron encontradas con respecto a las prevalencias de leptospirosis y demostramos la necesidad de programas educativos en áreas rurales para prevenir la transmisión de la enfermedad. El diagnóstico diferencial de leptospirosis en mujeres con aborto puede contribuir a mejorar los programas de prevención contra dicha enfermedad incluyendo educación en infecciones zoonóticas como leptospirosis a médicos en hospitales rurales.
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